摘 要： 蛋白質(zhì)吸附、鈣磷離子釋放和表面生物礦化是鈣磷材料誘導(dǎo)異位骨生成的可能材料機制。對比了非表 面微孔羥基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｓ）、表面微孔羥基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｒ）和表面微孔生物惰性非鈣磷陶瓷（ＴｉＯ２ 陶瓷； 氧化鋁陶瓷；兩者無鈣磷釋放，無表面生物礦化能力）的異位骨誘導(dǎo)能力。研究發(fā)現(xiàn)，不同化學(xué)成分的陶瓷材料對 蛋白質(zhì)有選擇性吸附。即使不吸附骨形態(tài)發(fā)生蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２），具有表面微孔的非鈣磷陶瓷也能誘導(dǎo)異位骨 組織生成。結(jié)果表明，鈣磷離子釋放和表面生物礦化在磷酸鈣生物材料骨誘導(dǎo)中不起關(guān)鍵作用，表面微孔也不一 定通過蛋白質(zhì)吸附而在異位骨誘導(dǎo)中起作用。
０ 引 言
發(fā)生在非骨部位的骨再生生物學(xué)過程叫骨誘導(dǎo)， 骨誘導(dǎo)較的例子是含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ＢＭＰ） 的種植體在軟組織中的骨組織生成。在不加生長 因子的情況下，具有特殊物理化學(xué)特性的磷酸鈣陶瓷 也具有骨誘導(dǎo)能力。其中，材料表面微孔性扮演重 要角色。具有表面微孔的羥基磷灰石陶瓷在肌肉種植 后能夠誘導(dǎo)骨組織生成，但是沒有表面微孔的羥基磷 灰石陶瓷沒有骨誘導(dǎo)能力。
由于磷酸鈣材料對骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ＢＭＰ）有較 強的吸附能力，具有表面微孔的磷酸鈣陶瓷的骨誘導(dǎo) 作用通常被解釋為微孔擴大了磷酸鈣陶瓷的表面積， 從而可以從體液中吸附更多的蛋白質(zhì)（包括骨誘導(dǎo)因 子如ＢＭＰ），而這些被吸附在鈣磷陶瓷表面的蛋白質(zhì) 骨誘導(dǎo)因子較終誘發(fā)了骨組織形成。
另外近年來發(fā)現(xiàn)鈣，磷離子對多潛能干細胞的骨 相分化有促進作用。磷酸鈣陶瓷表面微孔在骨誘 導(dǎo)中的作用也被解釋為微孔增加磷酸鈣陶瓷的表面 積，從而有利于鈣磷離子的釋放，釋放的鈣磷離子可能 引發(fā)骨誘導(dǎo)。
磷酸鈣材料是典型的生物活性材料。在體液中磷 酸鈣陶瓷材料能在其表面形成類骨磷灰石層。磷 灰石層的形成以及在磷灰石層形成過程中參與進來的蛋白質(zhì)（包括生長因子）也被認為是磷酸鈣陶瓷骨誘導(dǎo) 的可能原因。
本文考察了不具備表面微孔的羥基磷灰石陶瓷 （ＨＡ－Ｓ），具備表面微孔的羥基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｒ）， 具備表面微孔的ＴｉＯ２ 陶瓷和氧化鋁 陶瓷的蛋白吸附 能力，并比較這些陶瓷材料的異位成骨能力。以期論 證蛋白質(zhì)吸附，鈣磷離子釋放和表面生物礦化在生物 材料異位骨誘導(dǎo)中的可能作用。
１ 實 驗
１．１ 材料制備
陶瓷材料用雙氧水發(fā)泡，并在高溫下燒結(jié)制備。 具體來說，羥基磷灰石粉末（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ），二氧化 鈦粉末（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）以及三氧化二鋁粉末 （Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），分別用稀釋的雙氧水溶液（２％ （質(zhì)量分數(shù)））混合均勻，然后在６０℃進行發(fā)泡和干燥， 制備成陶瓷坯體。ＨＡ胚體在１?。玻担啊鏌Y(jié)８ｈ得到 非微孔的的羥基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｓ），在１１００℃燒結(jié) ８ｈ得到微孔的羥基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｒ）。ＴｉＯ２ 陶瓷 在１２００℃燒結(jié)２００ｍｉｎ，氧化鋁 陶瓷在１３００℃燒結(jié) １０ｈ。燒結(jié)后的陶瓷塊加工成直徑為５ｍｍ，長度為 ６ｍｍ的柱狀樣品，然后分別用丙酮，７０％（質(zhì)量分數(shù)） 乙醇和去離子水很聲清洗，干燥后在１２１ ℃下滅菌 ３０ｍｉｎ。
１．２ 材料表征
用Ｘ射線衍射儀（Ｘ’Ｐｅｒｔｐｒｏ－ＭＰＤ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ） 分析陶瓷材料的化學(xué)成分；對材料的表面結(jié)構(gòu) 進行掃描電鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｓ４８００，Ｊａｐａｎ）觀察；用ＢＥＴ （ＴｒｉｓｔａｒⅡ３０２０，Ａｍｅｒｉｃａ）方法檢測陶瓷材料的表面 積。
１．３ 牛血清蛋白（ＢＳＡ）和溶菌酶素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）的吸 附
將陶瓷樣品（ｎ＝３）分別浸泡在３ｍＬ含有２５× １０－６疊氮化鈉（ＮａＮ３）和２００μｇ／ｍＬ牛血清蛋白（Ｆｌｕｋａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）或者２０μｇ／ｍＬ 溶菌酶素（Ｆｌｕｋａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）或者１％（質(zhì)量分數(shù)）胎牛血清（ＦＢＳ， ＧｉｂｃｏＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＫ）溶液中，并在 ３７℃水浴中震蕩。７ｄ后，將樣品離心（３ ０００ｒ／ｍｉｎ） ５ｍｉｎ，取上清液作蛋白分析。用ＢＣＡ 蛋白濃度檢測 法（Ｍｉｃｒｏ?。拢茫粒裕停穑颍铮簦澹椋睢。幔螅螅幔。耄椋?，ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）檢測蛋白質(zhì)，并用相應(yīng)蛋白 的標準曲線計算蛋白濃度。
１．４ ｒｈＢＭＰ－２的吸附 將４種陶瓷樣品（ｎ＝３）浸泡在３ｍＬ含有５００ｎｇ ｒｈＢＭＰ－２／ｍＬ（Ｈｕａｄｏｎｇ?。牛幔螅簦茫瑁椋睿帷。穑瑁幔颍恚幔悖澹酰簦椋悖幔?ｇｒｏｕｐ?。椋睿觯澹螅簦恚澹睿簟。茫铮蹋簦?，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）的細胞 培養(yǎng)液中。細胞培養(yǎng)液由ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ?。悖铮颍穑铮颍幔簦椋铮睿眨耍?，１０％ 胎牛血清（ＦＢＳ）（ＧｉｂｃｏＴＭ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ?。悖铮颍穑铮颍幔簦椋铮?，ＵＫ），１００μｇ／ｍＬ盤尼西林和１００μｇ／ｍＬ鏈霉素組成。樣品在３７ ℃，５％ ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中孵化２４ｈ后，用磷酸鹽緩沖液（ｐＨ 值＝ ７．４）潤洗３次，并保存在－８０℃。１２ｈ后每個樣品添 加０．５ｍＬ?。保?Ｔｒｉｔｏｎ并在４℃冰箱保存。１２ｈ后，樣 品在很聲波水浴中處理５ｍｉｎ。離心（Ｘ３ ０００ｒ／ｍｉｎ） ５ｍｉｎ，依照ｒｈＢＭＰ－２酶聯(lián)免疫反應(yīng)測定法（ｒｈＢＭＰ－２ Ｅｌｉｓａ，Ｒ＆Ｄ，ＵＫ）測定上清液中的ｒｈＢＭＰ－２蛋白濃 度。
１．５ 動物實驗
６條成熟雄性狗（體重為１０～１５ｋｇ）在本地購買。 麻醉（戊巴比妥鈉（３０ｍｇ／ｋｇ）），消毒（酒精，碘伏）后， 在狗背部用手術(shù)刀劃開一個縱向皮膚切口并暴露肌 肉，再鈍性分開肌肉成袋狀，將樣品植入肌肉袋中。
４個單獨的肌肉袋間隔２ｃｍ 左右，每個肌肉袋中種植 一個樣品。手術(shù)后，肌肉連續(xù)注射青霉素３ｄ，防止感 染。１２周后，用過量的戊巴比妥鈉處死動物，取出樣 品并固定在４％的福爾馬林溶液中（ｐＨ 值＝７．４）。 １周后，取出樣品，用ＰＢＳ沖洗，梯度酒精（７０％，８５％， ９０％，９５％，１００％×２）脫水，ＭＭＡ包埋。硬組織切片 機（Ｌｅｉｃａ?。樱校保叮埃埃牵澹颍恚幔睿┣衅ǎ保啊玻?mu;ｍ）。亞 甲基藍和品紅染色后，作定性和定量的組織學(xué)觀察。
為了組織形態(tài)學(xué)分析，切片首先用掃描儀（Ｄｉｍａｇｅ Ｓｃａｎ?。牛欤椋簦濉。担矗埃埃桑桑剩幔穑幔睿呙?，然后用ＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ５ 處理圖片，讀出選中區(qū)域、材料、骨頭三者的像素值，根 據(jù)公式
計算陶瓷材料大孔中的成骨量和材料在樣品中的 百分比。用光學(xué)顯微鏡（Ｎｉｋｏｎ?。牛悖欤椋穑螅濉。牛玻埃?，Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）觀察樣品中的組織成分（血管，新生骨組織和成 骨細胞）。
１．６ 統(tǒng)計學(xué)分析
數(shù)據(jù)均采用平均值加減標準方差的形式表達。用 量化Ｔｕｒｋｅｙ對比對數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析，ｐ ＜０．０５被認定為顯著性差異。
２ 結(jié)果與討論
２．１ 材料表征
材料的ＸＲＤ圖譜如圖１所示。由圖１可知，ＨＡＳ 和ＨＡ－Ｒ在不同溫度燒結(jié)（ＨＡ－Ｓ，１２５０℃；ＨＡ－Ｒ， １１００℃），但它們的特征峰與標準羥基磷灰石一致。 ＴｉＯ２ 在２θ＝２７．６，３６．２８，４１．４，５４．５，５６．７８和６９．１６°有 明顯的特征衍射峰，與ｒ－ＴｉＯ２ 的ＸＲＤ 標準峰一致。
氧化鋁 在２θ＝２５．７，３５．３，３７．９，４３．４８，５２．６８，５７．６２， ６６．６２和６８．３２°處有明顯的特征衍射峰，與α－氧化鋁 的 ＸＲＤ標準峰一致。
從圖１可知，１?。玻担啊鏌Y(jié)后，ＨＡ晶體熔融在一起，導(dǎo)致ＨＡ－Ｓ形成較光滑的表面（圖２（ａ）），但是 １ １００℃燒結(jié)的ＨＡ－Ｒ表面有豐富的微孔（圖２（ｂ））。 ＴｉＯ２ 表面同樣可以看到豐富的微孔（圖２（ｃ））。在 １ ３００℃下，很少氧化鋁 晶體（細微顆粒）熔融，顆粒堆 疊在一起形成微孔（圖２（ｄ））。ＢＥＴ 無法檢測ＨＡ－Ｓ 表面積，ＨＡ－Ｒ的表面面積為０．７７７ｍ２／ｍＬ，ＴｉＯ２ 的 表面面積為０．１０２ｍ２／ｍＬ，氧化鋁 為０．２０６ｍ２／ｍＬ（表 １）。４種不同的微孔表面結(jié)構(gòu)，材料的表面積不同。
２．２ 蛋白吸附
浸泡７ｄ后，不同材料吸附牛血清蛋白（ＢＳＡ）的 能力各不相同（圖３（ａ））。ＨＡ－Ｓ吸附（６４±８）μｇ ＢＳＡ （占總ＢＳＡ的（１１±１）％），ＨＡ－Ｒ吸附（４８５±５）μｇ?。拢樱粒ㄕ伎偅拢樱恋模ǎ福?plusmn;１）％），ＴｉＯ２ 吸附（１８２±１２）μｇ?。拢樱?（占總ＢＳＡ 的（３０±２）％），氧化鋁 吸附（２１７±１６）μｇ ＢＳＡ（占總ＢＳＡ的（３６±３）％）。
浸泡7ｄ后，不同材料吸附溶菌酶素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ） 的能力各不相同（圖３（ｂ））。氧化鋁 能吸附溶菌酶素 較多，ＨＡ±Ｓ吸附較少。ＨＡ±Ｓ吸附（１±１）μｇ（占總 量（２±２）％），ＨＡ±Ｒ 吸附（６±１）μｇ（占總量（１０± ２）％）。ＴｉＯ２ 吸附（２０±１）μｇ（占總量（３３±１）％）。
氧化鋁 吸附（５１±１）μｇ（占總量（８５±１）％）。 浸泡７ｄ后，不同材料吸附ＦＢＳ的能力也不一樣 （圖３（ｃ））。ＨＡ－Ｓ吸附較少（占總量的６％），ＨＡ－Ｒ吸 附較多（占總量的３４％），ＴｉＯ２ 和氧化鋁 吸附的量大 致一致（分別占總量的１２％和１２％）。
陶瓷材料化學(xué)成分不一樣，蛋白質(zhì)吸附能力不同。 微孔的ＨＡ－Ｒ總比無微孔的ＨＡ－Ｓ吸附更多的蛋白 質(zhì)，說明對于同一材料，蛋白質(zhì)吸附與材料微孔和表面 積有關(guān)。
２．３?。颍瑁拢停校参?/p>
ＨＡ對ｒｈＢＭＰ－２有很強的吸附能力，與微孔和表 面積有關(guān)，而ＴｉＯ２ 和氧化鋁 陶瓷對ｒｈＢＭＰ－２的吸附 能力很弱（圖４所示）。
浸泡２４ｈ后，ＨＡ－Ｓ吸收（２１．４±４．６）ｎｇ?。颍瑁拢停校?（占總量的（１．４０±０．３３）％），ＨＡ－Ｒ 吸收（４２．９±５．３）ｎｇ?。颍瑁拢停校玻ㄕ伎偭康模ǎ玻福?plusmn;０．３３）％），ＴｉＯ２ 吸收 （２．２±０．８）ｎｇ?。颍瑁拢停校玻ㄕ伎偭康模ǎ埃保?plusmn;０．０６）％）， 氧化鋁 吸附（０．４±０．２）ｎｇ?。颍瑁拢停校玻ㄕ伎偭康模ǎ埃埃?plusmn; ０．０１）％）。這個結(jié)果驗證了鈣磷陶瓷對ＢＭＰ有較強 的親和力，但結(jié)果也同時顯示ＴｉＯ２ 和氧化鋁 陶瓷對 ｒｈＢＭＰ－２的吸附能力很弱。
２．４ 陶瓷材料的成骨能力
肌肉種植１２周后，所有ＨＡ－Ｒ，ＴｉＯ２，氧化鋁 植入 體都有骨組織生成，但在ＨＡ－Ｓ中沒有骨生成（表１）。 在ＨＡ－Ｓ里只發(fā)現(xiàn)纖維組織和血管（圖５（ａ），（ｅ））。除 了纖維組織和血管外，在ＨＡ－Ｒ的大孔表面還發(fā)現(xiàn)有 礦化的骨組織（圖５（ｂ），（ｆ））。與ＨＡ－Ｒ 類似，ＴｉＯ２ （圖５（ｃ），（ｇ））和氧化鋁（圖５（ｄ），（ｈ））大孔中有纖維 組織，血管和新生骨組織。
組織形態(tài)定量分析總結(jié)在圖６和表１，陶瓷種植 體具有不同材料百分比。ＨＡ－Ｓ中材料占（５０．７± ２．８）％，ＨＡ－Ｒ中材料占（５２．４±５．１）％，ＴｉＯ２ 中材料 占（６３．５±１３．３）％，氧化鋁 中材料占（６３．５±１０．２）％。 樣品中的成骨量也有差異。ＨＡ－Ｒ中成骨量為（７．６± ３．０）％，ＴｉＯ２ 中成骨量為（１．９±１．０）％，氧化鋁 中成骨量 為（１２．１±５．６）％。由于制備陶瓷的材料百分比不同 （表１），陶瓷有不同的孔隙率，因而無法排除大孔孔隙 率對成骨量的可能影響。但單從新骨發(fā)生率的不同， 可以討論材料因素在生物材料骨誘導(dǎo)中的可能功能。
ＨＡ－Ｒ能夠吸附更多的ｒｈＢＭＰ－２，ＴｉＯ２ 和氧化鋁 陶瓷幾乎不吸附ｒｈＢＭＰ－２（圖４），而它們都能誘導(dǎo)骨生成（表１，圖５和６）。不同化學(xué)組分的陶瓷材料蛋白 質(zhì)吸附（圖３和４）和成骨能力的比較不能明確蛋白質(zhì)吸附在生物材料骨誘導(dǎo)中的關(guān)鍵作用。 由于鈣磷離子分別對多潛能干細胞的骨相分化有 促進作用，鈣磷離子釋放也通常作為解釋磷酸鈣陶瓷 誘導(dǎo)成骨的原因之一［４］。本文中，骨組織再生除了發(fā) 生在微孔結(jié)構(gòu)的ＨＡ－Ｒ 里，也發(fā)生微孔ＴｉＯ２ 和 氧化鋁 陶瓷里。因為ＴｉＯ２ 和氧化鋁 陶瓷根本無法釋 放出鈣磷離子，所以這個結(jié)果否定了鈣磷離子在骨誘 導(dǎo)中的關(guān)鍵作用。
由于鈣磷離子釋放和重新表面沉積，材料表面形 成類骨磷灰石層，從而使磷酸鈣陶瓷具有生物活性。在類骨磷灰石層形成過程中，體液中的生長因 子參與生物礦化，從而引起生物反應(yīng)，這也被用來解釋 磷酸鈣陶瓷骨誘導(dǎo)現(xiàn)象。單純的ＴｉＯ２ 和氧化鋁陶瓷是典型的生物惰性材料，不會在模擬體液中形成表面類骨磷灰石層。所以，ＴｉＯ２和氧化鋁陶瓷誘導(dǎo)成骨 的結(jié)果否定了生物礦化在生物材料誘導(dǎo)成骨中的關(guān)鍵 作用。 近年來，生物材料的表面物理特性的生物效應(yīng)研 究取得進展。多潛能干細胞可能根據(jù)材料表面微 孔結(jié)構(gòu)而改變它們的形態(tài)，而這種細胞形態(tài)改變引起 細胞的骨相分化。特異的生物材料表面微孔可能直接誘導(dǎo)骨組織生成。
３ 結(jié) 論
（１） ＳＥＭ 和ＢＥＴ的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以雙氧水為 發(fā)泡劑，高溫?zé)Y(jié)而成的４種陶瓷具有不同的表面結(jié) 構(gòu)和表面積。
（２） 不同化學(xué)組分的陶瓷材料蛋白質(zhì)吸附和成 骨能力的比較不能明確蛋白質(zhì)吸附在生物材料骨誘導(dǎo) 中的關(guān)鍵作用。
（３）?。裕椋希?和氧化鋁陶瓷誘導(dǎo)成骨的結(jié)果表明微 孔并不是通過鈣磷離子釋放和表面生物礦化而起作 用，也不一定通過蛋白質(zhì)吸附引起骨誘導(dǎo)。